专家就是专家，兄弟就是兄弟

tiffany · Post by **tiffany** » 2007-04-24 13:54

最近为了调剂生活，开始做一个没做过的实验，生化，先IP再西点，就是看蛋白质跟蛋白质是否自然的状态下能形成一个大的复合蛋白。结果西点出来很多条莫名其妙的蛋白质条带，同实验室人一问，均无好的建议。乃于昨晚致电一个兄弟，蛋白质的专家，请教这个技术问题。我刚一说症状，人家就问出来专业问题说：你这个IP抗体是从谁身上的？我乃说：小老鼠。接着问，你西点用的第一个抗体是谁身上的？我答：小老鼠。人家马上问道：你是否有条分子量２５k的蛋白？还有一条７５的？我说：是啊是啊，第一条带出来的就是它们，还特清楚！专家说：这个是你IP抗体被你的西点抗体认出来了，２５k那条带是抗体轻链；７５那条是重练。你换个兔子的西点一抗，效果可能会好一点。再有问题，再电话来。吾于电话这头点头哈腰的谢了人家，跟良人报告说专家真是专家这一电话后感。良人说，你们那个新近薄厚不也老做么？可能人家不愿意告诉你。我一想也有可能，遂大力感慨说这种无私分享个人工作经验的事情真是只有兄弟专家才会干的啊！

Knowing · Post by **Knowing** » 2007-04-24 13:56

小白的工作真神秘！

一头雾水的说

洛洛 · Post by 洛洛 » 2007-04-24 14:05

就是，明明写的是中文...

dropby · Post by **dropby** » 2007-04-24 14:26

而且又没有生字生词.

silkworm · Post by **silkworm** » 2007-04-24 14:43

问题是我还得把中文翻成英文才明白您说什么呢。

Jun · Post by **Jun** » 2007-04-24 14:50

I only got western block.

森林的火焰 · Post by **森林的火焰** » 2007-04-24 15:11

IP还有一个tricks是别下太多proteinA/G agarose beads。如果beads用得太多，真叫泥沙俱下，啥都能裹挟下来。GST pull-down也一个道理。我一开始老怕不够，没有结果，狠狠的用，结果负对照也有带。后来终于想开了，就用10微升的珠子，才有瓜清水白的结果。
另外你做西点的抗体是商业买回来的还是自己打兔子的血清？

miumiu · Post by **miumiu** » 2007-04-24 16:15

immuno- precipitation？
翻译成中文我反而看不懂了

Elysees · Post by **Elysees** » 2007-04-24 17:50

啧啧，你们这些学生物的，蛮可以用暗号说话了。

lvxiu · Post by **lvxiu** » 2007-04-24 18:46

我也就看明白西点了

pomo · Post by **pomo** » 2007-04-24 22:19

我虽然看不懂，可是我越来越仰慕小白……

橙 · Post by 橙 » 2007-04-24 22:28

森林的火焰 wrote:IP还有一个tricks是别下太多proteinA/G agarose beads。如果beads用得太多，真叫泥沙俱下，啥都能裹挟下来。

那是因为您preclear放的不够多。不然才不会呢。
另外白同学这问题也不是做ip的都知道。也许那名薄厚就不知道也未可知。不过就算不知道，难道您不先检验不加抗体以及只加抗体但是不加样品的时候能pull down啥么？就用beads直接。。。厄。。。西点，用您的话说。

森林的火焰 · Post by **森林的火焰** » 2007-04-24 23:16

橙 wrote:
森林的火焰 wrote:IP还有一个tricks是别下太多proteinA/G agarose beads。如果beads用得太多，真叫泥沙俱下，啥都能裹挟下来。
那是因为您preclear放的不够多。不然才不会呢。
另外白同学这问题也不是做ip的都知道。也许那名薄厚就不知道也未可知。不过就算不知道，难道您不先检验不加抗体以及只加抗体但是不加样品的时候能pull down啥么？就用beads直接。。。厄。。。西点，用您的话说。

我心虚地说，厄，那个，啥是preclear？我自从少用了珠子，pull-down就不成问题了。抗体不能用同一物种的，这个我们以前的博后倒是教过我的。我用的西点一抗一般是兔子的，二抗一般是驴的，老死不相往来。

gigi · Post by **gigi** » 2007-04-25 6:29

Preclear ¾ÍÊÇ¼ÓIP¿¹ÌåÇ°ÏÈ°Ñlysate ºÍ beads »ìºÍÒ¡»Î¸ö°ÑÐ¡Ê±£¬ÔÙÈ¥µôÖé×Ó£¬¼ÓIP¿¹ÌåºÍÐÂbeads¡£ÁíÒ»½ÚÊ¡Ê±¼äºÍ¼õÉÙ±³¾°µÄ·½·¨ÊÇÖ±½Ó°ÑIP¿¹Ìåimmobilize µ½Öé×ÓÉÏ£¬±ÈÈçÊ¹ÓÃ Pierce µÄ ProFound Co-Immunoprecipitation Kit¡£

ÓÐÊ±²»ÈÝÒ×ÕÒµ½ºÏÊÊµÄIP ºÍWB ¿¹Ìå£¬ÔÚÁ½ÖÖ¿¹Ìå¶¼À´×ÔÍ¬Ò»ÎïÖÖµÄÇé¿öÏÂ£¬¿ÉÒÔ¿¼ÂÇÓÃ Santa Cruz Biotechnology µÄ ExactaCruz™ IP/Western Blot Reagents¡£
http://www.scbt.com/exactacruz.html
Ë³±ãÌáÒ»¾ä£¬Santa Cruz Biotechnology°Ñ²»ÉÙ³£ÓÃµÄIP¿¹ÌåÁªµ½Öé×ÓÉÏÖ±½ÓÂô£¬Õâ¾Í¸üÊ¡ÊÂ¶ùÁË¡£

°×½ð£¬ÔÛÕâ¶ù¶àµÄÊÇ×¨¼Ò£¬ÓÖ¶¼ÊÇÐÖµÜ£¬ÓÐÎÊÌâÖ±½ÓÀ´Õâ¶ùÎÊËãÁË¡£ÉúÎï¿Æ¼¼¹¤×÷Õß³Ã»ú¶àÊÕ»ñ¼¸¿ðÑöÄ½µÄÄ¿¹â¡£

tiffany · Post by **tiffany** » 2007-04-25 8:54

水果您老说那个单抗体对照也太费钱了，我老省了。。。倒是把preclear的beads样品给存下来了，但是没lane跑它了。

gigi说的这个有道理。

Knowing · Post by **Knowing** » 2007-04-25 9:21

生物女青年们好牛啊！敬仰的吐出一口血漂走。

tiffany · Post by **tiffany** » 2007-04-25 10:54

这个实验比做饭容易，其实，我们系一个高中小姑娘课余做了一两年的，发了篇特牛杂志的文章。然后她想念研究生，学生物，同实验室俩薄厚都劝她别，前途黯淡；她一反问，那你们怎么都干着呢？俩薄厚没话了。
其实原理很简单，蛋白质基本上就是带点儿电的大分子，给加个电场会跑，分子量小的跑得快，大的跑得慢；蛋白质的跑场是胶，跑道就叫lane，跑完了一染，就看见每条lane上有一条一条的蛋白质带－－－就是有颜色的一横。那么为了认出来这个带是什么，就拿去西点一下儿，也就是给蛋白胶加一个横向的电场，让胶里的蛋白质挪到膜－－－所谓膜，我觉得就是特殊塑料纸－－－上去。然后下抗体认蛋白。有该抗体认得－－－所谓认得，就是能跟这个蛋白连上－－－的蛋白的话，在膜上就显示有带。
所谓IP，说的是提炼跑胶蛋白的一种方法。因为一个蛋白质往往是跟别的蛋白质连在一起的，那么为了看看蛋白A是否跟蛋白B连着，我们就可以下认得蛋白A的抗体，然后再下beads把抗体给拖下来。如果AB连着，那么B就一起给拖下来了。然后去跑胶西点，如果西点出来，看见B了，那就连着；如果没看见，那就有可能不连着。当然其中技术细节，我这等无经验人事还是得向广大兄弟专家讨教的。

Knowing · Post by **Knowing** » 2007-04-25 11:00

那跑步得掐时间吧？不然大家就都跑到头了。
为什么抗体连上了就有带？抗体带颜色么？
BEADS 怎么能把抗体拖下来？他们连着不会跑的慢么？

Jun · Post by **Jun** » 2007-04-25 11:08

这个抗体有时候是带上了radioactive标签的，一拍就认出来了。我不知道真正生物学家们是不是用这个。

珠子是什么？业余科学爱好者要求解释！

tiffany · Post by **tiffany** » 2007-04-25 11:21

哦，对了，那些蛋白质样品里面都有染料，跑的最快，看染料跑到一个差不多边缘的位置，就不让他们跑了。
西点么，用两个抗体，第一个抗体是认目标蛋白的，第二个抗体是认第一个抗体的，这第二个抗体上还连了个什么东西，下点儿什么药一作用会显色。那么如果目标蛋白在膜上，就被认得它的第一个抗体连上了（在理想世界里，这个抗体认得且只认得这个目标蛋白），第二个抗体认得第一个抗体，又连上了，一下药，第二个抗体上连的那个东西就显色了，这个目标蛋白就出带了。
beads是agarose那种胶兮兮的东西，我也不知道它为什么就能连蛋白。它把蛋白给拖下来以后，再加药水煮，把蛋白就洗下来了。最后跑胶的时候，还是纯蛋白跑。

tiffany · Post by **tiffany** » 2007-04-25 12:29

通过调查，我明白为什么那个beads会拖蛋白了。这个agarose胶珠连了蛋白A/G，这个蛋白A/G乃是连抗体的。基本上就是beads上面连蛋白A/G，蛋白A/G连抗体，抗体上连其认得的蛋白，抗体认得的蛋白连别的跟它有关系的蛋白。

森林的火焰 · Post by **森林的火焰** » 2007-04-25 12:33

第二个抗体是“抗抗体的抗体”，连的东西是”辣根过氧化物酶”。

用药水一泡它会发荧光。或者用胶片感光，或者拿到个什么特殊的扫描仪上扫，就能检测到。

silkworm · Post by **silkworm** » 2007-04-25 14:22

这是IP免疫沉淀的示意图。
珠子上有蛋白质A（真叫这名字），你的蛋白质暂且叫X，和X能结合的蛋白质叫Y。下点能专门识别蛋白质X的抗体（图中Y形状的东西），可以捉住X以及和X结合着的Y。再往里下点珠子，就把一团东西都给捉住了，一离心，吧唧，沉到试管最下面了。是为免疫沉淀。

这时把连着一团东西的珠子洗洗，把上面连着的东西“弄”下来，在胶上跑跑（电泳）。各种组分就会依其个头以及带电的性质不同，而跑得不一样快，被大致分开。不过此时蛋白质条带是啥也看不见，更别提哪条是哪条了。

这是蛋白质在胶上走完电泳，转到膜上进行“西点”，使用一抗和二抗，再显色的示意图。

一抗(1 Ab)是专门对应你研究的蛋白质的，一般拿到这个有趣的蛋白质，可以制造一抗---给动物（兔子，大小鼠，猪，驴……）注射，过阵子提取血清。而二抗（2 Ab）有卖的，一抗是哪种动物里造出来的，就用哪种二抗。二抗一头儿是认一抗的，另一头儿耦合了一个酶，可以是过氧化物酶，也可以是碱性磷酸酶。这些酶的特点是，加进一种特殊的化学物质，即酶的底物，这些酶会咔嚓把那化学物质切上一刀，结果那化学物质上就掉下一个东西来，这东西（比如吲哚）一般是有颜色的（蓝紫）基团。这样蛋白质条带就瞧见了。

pomo · Post by **pomo** » 2007-04-25 19:43

你们解释得真好。我这个爱科学女青年其实看完就去找朋友学习了，结果她说的完全没有你们这么直白好懂。我就记得蛋白质印迹，抗一，抗一的抗二的……
我得把她叫来反省一下，她科普的态度很不端正！

笑嘻嘻 · Post by **笑嘻嘻** » 2007-04-26 0:20

我上下扫描了一眼。都是中国字儿。
文艺笑嘻嘻题。

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-05-14 22:10

大家好，我是刚入谷的后背晚生，也想请教几个问题。Preclear的作用是啥？我做实验遇到的问题是在西点的时候，蛋白G或蛋白A会出来一条非特异的带，和我的目的蛋白非常接近，有时候会覆盖目的带。大家有没有高招啊

tiffany · Post by **tiffany** » 2009-05-14 22:48

不然让公司直接把抗体给你连到beads上去？

dropby · Post by **dropby** » 2009-05-15 1:06

我决定培养欢欢继承各位的伟大神秘事业。我自己就算了。这比小k讲的金融还难懂。

Knowing · Post by **Knowing** » 2009-05-15 4:37

我讲金融怎么难懂啦？明明是浅入浅出的讲滴！

森林的火焰 · Post by **森林的火焰** » 2009-05-15 6:02

你那条非特异的带有多大，你的目标蛋白有多大？
一个方法是，如果有可能，给你的目标蛋白加一个epitope tag再表达，用epitope tag的抗体。
另外，如果分子量接近但是能分开，就把胶跑得久一点，尽量分开。有些抗体目标性不太好，但是只要negative control清楚，证明目标蛋白是特异的就可以达到目的。

tiffany · Post by **tiffany** » 2009-05-15 8:51

哦，对了。要是你确认是protein A/G的话，把eluding的buffer弄温和些不知道会不会好点儿。

不过这个得等蚕博，伊知道的应该比较多。

silkworm · Post by **silkworm** » 2009-05-15 10:02

后背晚生？对前胸老生？

我都不记得这是个老贴了，直到赫然看见我自己还发过言呢，吓一跳。

Preclear的作用是啥？

前面gigi有解释过的。我再

lucoco · Post by **lucoco** » 2009-05-15 18:37

那个问题问得实在太不清楚啦！
Protein G/A 掉下来的可能性很小很小的，用之前不都要先拿elution buffer洗上个3遍5遍的？（当然洗完之后你还可以看看wash里面有没有东西，起码测个OD280).
如果非特异的带出在protein G/A+Antibody的对照上，那可能是你的二抗（显色抗体）跟你的ip抗体有交叉反应。
要分开两条带的话，除了跑久点，还可以试gradient gel。不知道具体的, protein G 大概是20kDa左右，你可以试5-20%应该能够分好点。